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靶向共價抑制劑藉由結合至非活性位之遠端Cys進行動態相關之異位調節以抑制拉薩熱病毒NPexo活性

碩士生 陳玉婷 撰

靶向共價抑制劑（targeted covalent inhibitors, TCIs）是指通過與特定胺基酸形成共價鍵來阻斷蛋白質活性的小分子化合物。這類抑制劑占市售藥物約30％，並且具有作為對抗癌症或病毒感染藥物之潛力。然而，根據已知的研究發現，部分TCI會結合到蛋白質高度保守的受質結合位或是活性位之外的位置，卻仍具有抑制效果。為了進一步了解TCI的抑制機制，本篇論文選擇PCMPS （p-chloromercuriphenyl sulfate）和PCMB （p-chloromercuribenzoate）這兩種抑制劑來研究TCI是否會造成蛋白質結構改變而影響其功能。

根據先前的研究，PCMPS和PCMB這類有機汞化合物會以共價鍵與Cys結合，降低多種酵素之活性，其中包含了DEDDh核酸水解酶家族。這個家族主要負責處理DNA或RNA受質，其成員涵蓋了RNase T、CRN-4、TREX1、TREX2、SARS-CoV2的nsp14以及拉薩熱病毒的NP exonuclease（NPexo）等，主要參與在DNA修復、基因毒性反應與RNA干擾等途徑中。部分成員具有作為對抗癌症或是病毒的藥物標靶之潛力，例如：TREX1的功能是降解會誘發細胞自體免疫反應的核酸產物，達到免疫沉默（Immune silencing）的效果，因此許多研究認為抑制TREX1是癌症免疫治療的可能途徑；而本篇主要研究的NPexo則是能降解游離的雙股RNA，幫助拉薩熱病毒逃過免疫辨識並抑制I型干擾素產生，若能抑制NPexo，可阻斷拉薩熱病毒逃避宿主先天性免疫(Immune escape)的機制，達到抗病毒的效果。

本文以PCMPS和PCMB這兩種典型的TCI作為模板研究其抑制機制：首先以活性分析確定了PCMPS、PCMB對於RNase T、TREX1、TREX2、nsp14、NPexo等蛋白質皆具有抑制活性之效果，為DEDDh核酸水解酶家族的廣泛抑制劑。再透過X光繞射蛋白質結晶結構技術和all-atom molecular dynamics (MD) simulations，分析PCMPS、PCMB與野生型或突變型NPexo複合體之結構資訊。闡明了在野生型NPexo中，PCMPS的結合位點為Cys409。然而在將NPexo的Cys409突變成Ala之後，從活性分析的結果顯示PCMPS對於NPexo仍具有抑制效果。藉由PCMPS與C409A突變型NPexo複合體的結構，發現PCMPS會與Cys461形成共價鍵，說明Cys461是C409的替代遠端位點。將上述兩個複合體結構分別與apo form的NPexo結構進行比對後，發現Cys409和Cys461兩者皆遠離NPexo與RNA結合區域及其活性位點，且整體結構無明顯差異，無法只以結構的觀點找出抑制機制。之後本文透過對PCMPS與野生型和突變型 NPexos進行all-atom MD simulations，揭示了一種異位抑制機制：即PCMPS結合到NPexo（例如：Cys409）時，雖然不是結合在活性位與受質結合位，卻會造成局部擾動，並且動態傳播至NPexo與RNA結合的區域，使NPexo結構產生動態改變，進而影響NPexo與RNA結合，抑制NPexo的核酸酶活性。EMSA實驗亦證實了此結論，當加入PCMPS後，NPexo與RNA的結合能力明顯下降，闡明了PCMPS確實會抑制NPexo結合RNA的能力。

本文證明了PCMPS和PCMB對DEDDh核酸酶家族具有廣泛的抑制效果，展現TCI具備對抗癌症或是病毒之潛力。並提供了第一個TCI與DEDDh核酸酶複合體的結構資訊，闡明PCMPS和PCMB這類有機汞化合物的抑制機制是以共價鍵結合至蛋白質活性位點或受質結合位遠端的Cys造成局部擾動，導致蛋白質結構產生動態變化，進而影響與受質的結合能力，達到抑制的效果。藉由釐清上述的結構資訊和抑制機制，表明了TCI靶向的胺基酸具有順序偏好性，會優先結合至某個特定胺基酸再結合至另一個胺基酸（例如：優先結合至Cys409，再選擇Cys461），且有一種抑制途徑是透過異位調節造成結構動態改變。這個新穎的蛋白質動態相關研究結果將為未來TCIs的藥物開發提供重要的分子基礎。

APE1 distinguishes DNA substrates in exonucleolytic cleavage by induced space-filling

誘導型空間填充模型所引導之APE1受質選擇機制

專題生 劉承霈 撰

Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1)是一個兼具核酸內切酶活性與3端至5端核酸外切酶活性的多功能酵素，可參與各種DNA修復過程來維持基因組的完整性，像是Base-excision repair(BER)、Nucleotide incision repair(NIR)和DNA single-strand breaks(SSB)…等等。在BER修復途徑中，APE1的內切酶活性對雙股DNA的缺鹼基位點(AP site)具有極高的專一性。而APE1的3端至5端外切酶活性則具有DNA結構的選擇性並在其它DNA修復路徑中扮演著重要的角色，如其它文獻指出APE1的外切酶活性更偏好切除因DNA複製錯誤產生的錯配(mismatch)鹼基，被認為具有校正DNA的功能，由此可見APE1具有識別特殊結構的雙股DNA之能力。另外有實驗證明APE1的外切酶活性對各種不同的鹼基則不具專一性，除了一般的鹼基外，尚可移除數種屬於核苷類似物的抗癌藥物，推測為癌細胞產生抗藥性的原因之一，因此瞭解APE1的外切酶活性對鹼基不具選擇性具有很大的生醫價值。

由上述可知APE1的內切酶活性對AP site十分專一；其外切酶活性對鹼基則不具專一性，且在降解不同結構的核酸上具有特異性，在生理上也具有重要意義。因結構資訊的缺乏造成難以瞭解在APE1表現外切酶活性時，與受質之間的交互作用及各種不同的催化選擇性。所以此篇透過結晶學的方法探討不同結構的雙股DNA會如何影響APE1的外切酶活性，進而了解其外切酶活性對受質結構的選擇性以及對鹼基的非特異性。

本篇論文以X光繞射蛋白質結晶結構技術解出第一個APE1與雙股DNA末端結合的晶體結構，從結構的角度說明APE1外切酶活性的作用機制。我們在該複合物中發現當雙股DNA結合至APE1時，APE1上的Arg176會和孤對鹼基(orphan base)還有附近的鹼基發生交互作用，並與Met269形成RM bridge，將活性位點區分為受質結合位與product pocket，讓孤對鹼基遠離活性位點進而打開鹼基對，使核苷酸進入product pocket，而product pocket的區域則可不透過特殊的交互作用力來容納各種DNA鹼基並且執行切除，也因此證實APE1的外切酶活性對鹼基不具專一性。從解出來的結構中還發現RM bridge會形成立體阻礙(steric hindrance)來限制product pocket的容納空間，若超出product pocket的容納範圍即會產生空間抵觸(steric clash)使核酸水解酶活性無法表現，由此解釋APE1內切酶活性對鹼基的專一性與外切酶活性對受質結構的特異性，進而推導出誘導空間填充模型(induced space-filling model)，用來瞭解APE1識別不同雙股DNA結構的分子機制。

為了有系統地確立APE1的核酸水解酶活性在結構上的偏好，本篇合成數段結構不同的雙股DNA，用以分析其外切酶活性偏好的受質結構與結合親和力(binding affinity)。我們透過活性試驗以及受質結合實驗確實發現APE1的外切酶活性對鹼基不具專一性，但當APE1遇到特定結構的受質，如3端有兩個(含)以上錯配鹼基的雙股DNA時，過長的單股DNA會因為立體阻礙而無法進入product pocket，除了導致鹼基無法被正常降解外，受質與APE1的親和力也大幅下降；但當遇到的核酸為鹼基配對正確或3端僅有一個錯配鹼基的雙股DNA時，因為不會產生立體阻礙，不論受質結構為3’-end recessed、1nt gapped dsDNA或是nicked dsDNA，APE1皆可正常表現其外切酶活性，也發現雙股DNA的 5端突出(overhang)的長度會影響其與APE1的親和力以及外切酶活性；在APE1的內切酶活性部分則只有AP site能夠在不產生空間抵觸的情況下進入product pocket，因此，從結構、誘導空間填充模型以及生化試驗皆解釋APE1的內切酶活性具有AP site的專一性而外切酶活性不具鹼基專一性但具有受質結構特異性的原因。

本篇顯示APE1在降解不同結構的雙股DNA時，透過形成RM bridge產生的立體阻礙來區別不同結構的核酸，進而造成APE1對這些核酸有不同的酵素活性與親和力，並且首次提出APE1內切酶與外切酶活性的誘導空間填充模型，此整合性的研究釐清APE1在體內作用的分子原理，也提供研發抗癌或抗病毒藥物的可能性。

從蛋白質結構了解TREX2如何結合及降解雙股DNA

專題生 紀雨彤 撰
博士生 武家昀 校稿

從3’端到5’端降解核酸的核酸水解外切酶，是DEDDh核酸水解酶家族的一員，此家族成員的共同特徵為在活性位點由三個Aspartate（Asp, D）、一個Glutamate（Glu, E）、Histidine（His, H）組成穩定結構。TREX2在人體內對於細胞增殖、基因組完整性及維持皮膚細胞穩定扮演著重要的角色。

細胞的存活需要依靠各種DNA修復(DNA repair)、複製後修復(Post-replication Repair)、DNA校對(DNA proofreading)等系統，這些系統如果有缺陷可能會導致癌症或是細胞死亡。TREX2和人類同源基因TREX1在哺乳類動物細胞中提供了主要的3’端到5’端核酸水解外切酶的活性，TREX2的核酸水解外切酶活性會負責降解3’端錯配的DNA序列，和染色體的修復與維持基因組的穩定都有關係。當強烈的紫外光照射下，TREX2會轉位至細胞核，並和DNA附近的組蛋白-γH2AX作用來修復受損的DNA末端。功能失常的TREX2會導致細胞增殖減少，並且增加皮膚被藥物或紫外光照射而產生癌變的機會，這說明了TREX2在DNA複製及腫瘤的抑制中起了重要的作用。另外，缺乏TREX2的細胞會產生自發斷裂的染色體，表示TREX2會參與無錯複製後修復(error-free postreplication repair)，對於抑制斷裂染色體的形成非常重要。然而，目前還無法確定TREX2是如何作用於DNA受質以維持基因組的穩定。

TREX2有著獨特的催化性能，主要分布在角質形成細胞，對於維持皮膚對DNA損傷的體內平衡相當重要。TREX2已經被證實在促進角質形成細胞死亡的過程中會降解DNA，是造成牛皮癬發病的關鍵因素，因此TREX2目前被認為是治療牛皮癬的一個有效治療標靶。

TREX2的同源蛋白TREX1同為DEDDh核酸外切酶家族的成員。TREX1和TREX2在序列比對中的相似性高達40%以上，且具有相似的受質偏好和催化活性，分布在細胞質內質網以及細胞核中。雖然他們的相似性極高，且結構非常相似，但研究卻發現他們在細胞中的表達位置，及生理上的功能皆不同。TREX1為一種免疫沉默因子(immune silencing factor)，負責代謝胞質中的核酸產物，避免核酸過多造成自體免疫反應發生。TREX1在細胞核中的功能包含DNA損傷誘導的複製、DNA校對(DNA proofreading)和DNA修復(DNA repair)途徑。研究中確認了TREX2與dsDNA的複合結構，有助於了解TREX1與TREX2兩個如此相似的核酸外切酶在細胞功能上的不同與特異性。

我們在本次研究中提出了4個新的晶體結構：apo-TREX2、TREX2和兩個不同的雙股DNA形成的複合體、以及TREX2與產物的複合物結構。經結構分析，對TREX2是如何結合受質以及作用的反應機制進行闡述，我們可以知道TREX2是通過Leu20-Pro21-Asn22 cluster與dsDNA的5’末端堆疊在一起，並精確的修剪3’突出端。另外，TREX2在通過一個α螺旋環區域與雙股DNA的非易斷裂鏈特異性相互作用，由TREX2-dsDNA複合物獨特的相互作用模式顯示出TREX2的結合需要長雙鏈區的存在，並提供TREX2在加工染色體DNA中的功能作用的證據。此外，TREX2與產物複合物結構亦說明TREX2的 non-processive 非連續性降解的分子機制。我們的研究揭示了TREX2及其受質之間分子相互作用的第一個結構基礎，說明TREX2的作用於長鏈雙股DNA的原理，並藉由其他DEDDh外切核酸酶-dsDNA/dsRNA複合物的結構比對，進一步討論DEDDh外切核酸酶的受質特定性，對未知的DEDDh核酸水解酶家族成員提供了細胞功能分類上的依據。

從蛋白質結構角度了解TREX1如何精準降解雙股核酸上的單股突出區域，
並進一步解開雙股核酸的配對區域

博士生 黃冠偉 撰

Three prime repair exonuclease 1 (TREX1) 為動物細胞中主要的 3 端至 5 端的核酸水解外切酶，屬於 DEDDh 核酸水解外切酶家族，此類酵素的活性特徵是能方向性的由 3 端至 5 端降解各種不同結構核酸分子中的 3 端單股區域。TREX1 的核酸降解功能在許多重要的細胞生理功能中扮演著重要的角色。

在正常的細胞中，DNA複製過程中產生的錯誤產物，或是不受限制的內生性逆轉錄因子 (endogenous retroelement) 等其他各式核酸，會誘發細胞產生自體免疫反應。而透過C端區域固定在胞質中內質網上的TREX1，能將這些核酸降解，達到免疫沉默 (Immune silencing) 的結果。因此若細胞中的 TREX1 產生缺陷將會導致許多自體免疫相關疾病的發生，諸如全身性紅斑狼瘡 (Systemic Lupus Erythematosus)、Aicardi 症候群 (Aicardi-Goutières syndrome)、營養不良相關視網膜病變 (Retinal Vasculopathy and Cerebral Leukodystrophy) 及凍瘡樣狼瘡 (Familial Chilblain Lupus)…等等，然而目前關於 TREX1 的生理功能與這些疾病的相關性研究仍然不足。此外，TREX1 還與人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）感染有關。在人體組織及小鼠實驗中發現，抑制 TREX1 酵素的表達量，能拖延病毒的感染進程及病毒複製，同時誘導細胞提高免疫系統中干擾素合成，此結果顯示 HIV 可能利用宿主細胞中的 TREX1 來躲避免疫系統的攻擊。故 TREX1 是一個具有高潛力的抗病毒藥物之標的蛋白。

除了上述情況外，TREX1 亦會脫離內質網，轉移進入細胞核內執行細胞凋亡或是DNA修復兩種截然不同的反應。當胞殺性T細胞 (Cytotoxic T lymphocyte) 及自然殺手細胞 (natural killer cell) 所分泌的 Granzyme A 蛋白酶進入細胞中，作用在內質網上的 SET 複合體，使其中的 TREX1 以及 NM23-H1 得以脫離內質網進入細胞核中，將染色體DNA降解，進而使細胞走向凋亡路徑。研究也指出 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 和 DNA polymerase β 需要藉由 TREX1 來執行DNA修復以及DNA校對 (DNA proofreading)。

此外，同為 DEDDh 核酸水解外切酶家族的大腸桿菌同源蛋白 RNase T，與 TREX1 在代謝各式結構 DNA 中有相似的特性。透過 in vivo 及 in vitro 的實驗結果，推測此兩酵素在UV誘導DNA修復及Endonuclease V 媒介替代性鹼基切除修復作用中，可能扮演相似的角色。然而 TREX1 與 RNase T 主要的差異在於 TREX1 能代謝雙股 DNA，而 RNase T 則不具備此活性。此一特性在 DEDDh 核酸水解外切酶家族中也是相當獨特，使得 TREX1 能代謝更多不同結構的核酸。然而截至目前為止僅有少數幾個雙股 DNA – TREX1 複合體結構，尚無法解釋 TREX1 代謝雙股核酸的機制。

因此，為了瞭解 TREX1 在不同生理反應中，如何代謝各式各樣的核酸受質，我們設計許多不同的 DNA，透過X光繞射蛋白質結晶結構方法，解出四種不同 TREX1-DNA 複合體結構，輔以酵素活性反應實驗來了解 TREX1 如何催化代謝不同的結構DNA。發現當代謝3’端單股突出的雙股DNA時，TREX1 會利用 N 端 Leu24-Pro25-Ser26 形成的小螺旋區域，在精準的將單股區域切除後，擋住雙股DNA中非作用股的5端，而留下雙股DNA的產物；若是能繼續提高 TREX1 濃度，甚至能透過此小螺旋，鑿開雙股核酸的鹼基配對區域，進而降解雙股DNA。此結果亦符合細胞中 TREX1 的分布，在胞質中因為固定在內質網上，相對濃度較高，故能切除雙股核酸，避免自體免疫反應產生；而當進入細胞核後，則能在低濃度的狀態下精準的執行DNA修復功能。此外，配合其他文獻的結構，我們整理出 TREX1 在代謝不同結構核酸時，透過不同的 DNA-蛋白質交互作用，影響其代謝活性。本研究不僅可用於了解 TREX1 在 DNA修補、由Granule 所誘導的細胞毒殺反應、自體免疫反應調控以及病毒感染等重要的細胞行為中所扮演的角色，還可釐清 TREX1 與自體免疫疾病的關係，甚至可以應用於抗病毒藥物之設計與研發上。

Identification of Inhibitors for the DEDDh Family of Exonucleases and a Unique Inhibition Mechanism by Crystal Structure Analysis of CRN‑4 Bound with 2‑Morpholin-4-ylethanesulfonate (MES)

博士生 杜春奕 撰

Cell death related nuclease 4 (CRN-4)是一種凋亡核酸酶，主要會參與在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)的細胞凋亡途徑進行水解DNA的功能。CRN-4屬於 DEDDh 核酸水解外切酶家族中的一員，其酵素的活性特徵為可以以3端到5端的方向降解各種不同結構核酸分子中的 3 端單股區域。所有 DEDDh 家族內的核酸外切酶皆具有DEDDh結構域，在此結構域內的活性區域內含3個天冬胺酸(aspartate)、1個穀氨酸(glutamate)和1個組胺酸(histidine)或酪胺酸(tyrosine)來與2個鎂離子結合。雖然 DEDDh 核酸外切酶具有相似的活性區域，但對於不同受質的偏好程度會因其結構上的差異導致有所不同。

DEDDh 核酸外切酶在真核或原核細胞內參與許多重要的生理反應，像是DNA複製、DNA修復與RNA修飾。因此當其功能出現異常時會對於人體造成致命性的影響並造成許多疾病，例如WRN的核酸外切酶結構域的突變與維爾納綜合症(Werner syndrome)有著密切的關聯、TREX1的突變會造成自體免疫反應疾病Aicardi症候群 (Aicardi-Goutieres syndrome)。除此之外，部分病毒的 DEDDh 核酸外切酶會與病毒感染宿主的能力有所關聯，像是HIV會利用宿主細胞內的TREX1來躲避免疫系統的攻擊。NP 核酸外切酶(NP exonuclease of Lassa virus)會去水解掉雙股RNA以避免作為病毒訊號的RNA被其宿主的免疫系統偵測到，藉此來抑制宿主內的先天性免疫反應。這類的 DEDDh 核酸外切酶皆可以作為藥物設計的目標，但目前對於哪類的抑制劑可以有效的抑制 DEDDh 核酸外切酶的資訊還是相當模糊，因此本篇希望藉由蛋白質活性測試來找出哪些抑制劑可以抑制 DEDDh 核酸外切酶的活性，並藉由其與抑制劑的晶體結構來了解其分子機制。

本篇首先藉由瀏覽相關的文獻，篩選出了9種皆被證實具有抑制核酸酶活性的抑制劑，而作為抑制目標的DEDDh 核酸外切酶則選用CRN-4與RNase T。在加入抑制劑的核酸外切酶活性測試與受質結合能力的活性測試中發現了4種抑制劑PCMPS、PV6R、ATA、DTNB可以很有效的抑制CRN-4與RNase T。同時為了證明這類抑制劑可以抑制病毒性的 DEDDh 核酸外切酶，我們以NP 核酸外切酶做為目標蛋白在核酸外切酶活性測試中證實ATA與PV6R可以有效抑制NP 核酸外切酶並且計算出了抑制劑的IC50 value。晶體結構分析方面，藉由CRN-4與抑制劑MES複合體的結構我們發現了其獨特的分子機制，MES會結合至CRN-4的 DEDDh 結構域，此時His179會轉移出活性區域達到抑制核酸外切酶的效果。本研究藉由MES-CRN-4的複合體釐清了抑制劑作用於 DEDDh 核酸外切酶的分子機制，並利用分子對接分析(Molecular docking analysis)找出抑制劑會與哪些活性區域內的胺基酸結合。這些結果皆可以應用於未來抗病毒藥物的設計與研發上。

從蛋白質結構了解RNaseT — 處理DNA之3 碳端的核酸外切酶 ，如何進行DNA修復

專題生 林頁彤 撰

DNA修復對保持個體基因完整性是非常重要的，然而，對於核酸外切酶如何辨認DNA受損位點的機制尚未清楚。RNaseT 在大腸桿菌中為含有DEDDh domain 的3 端至 5 端的核酸外切酶，參與DNA複製、重組、和修復的機制，而在DNA修復的機制中負責與DNA受損區域結合並加以修飾。本篇希望藉由解出RNase T 與DNA的複合物結構，了解RNase T 如何修復DNA，並探討其他核酸外切酶在不同修復途徑中如何準確地與DNA受損位置結合，以及在DNA修復中所扮演的角色。

為了確認RNase T 在 DNA修復中的功能，我們測量去除RNaseT 的細胞在各種能造成DNA受損的物質的敏感度，並發現去除RNaseT 的細胞敏感度相較於未去除RNaseT的細胞高。為了更進一步了解RNaseT參與的DNA修復機制，我們將RNaseT與不同的受損DNA物質進行反應，發現RNaseT會降解甲基化DNA和脫氨基的DNA，證明RNaseT在鹼基去除修復(base excision repair) 和alternative repair途徑中具有核酸外切酶的特性。
由上述可知RNaseT會參與DNA修復，接下來我們想探討RNaseT 會與那些受損的DNA 反應，例如bulge、bubble和Y-structured DNA。RNase T的活性會受到 C effect 和 double strand effect 影響，但經由實驗發現不具有3’突出端(overhang)結構的bulge 和bubble DNA可不受到 double strand effect 影響，RNaseT可藉由將Phe29插入bulge，使欲切割的序列進入活性區域並進行切割。另外，我們藉由RNase T 與DNA的共結晶結構發現RNase T與Y structured DNA 特殊的結合模式，Y structured DNA 會翻轉180 度以避免RNase T中的Phe29 所產生的屏障，也藉此特殊的結合模式，使Y structured DNA 中3碳端的cytosine 無法與RNaseT 中的Glu73形成氫鍵，並讓RNase T維持在活化的狀態。

Bubble 和bulge DNA 可藉由 EndoV 在距離受損位點一個核甘酸的位置進行單股切割(nicking)。因bulge DNA 的結構與EndoV nicking 製造出的bubble DNA 結構相似，故推測RNase T 為EndoV 的下游核酸外切酶。我們也藉由實驗證實RNase T在EndoV dependent DNA repair pathway 中與EndoV 合作，也推估RNaseT可以辨認EndoV產生的bulge 和bubble DNA，並加以修飾。

在大腸桿菌中除了RNase T 會參與DNA修復，還有另外兩個核酸外切酶分別為ExoI 和ExoX。RNase T、ExoI 和ExoX的外切酶活性可能是相似的，因此我們進行其對受質偏好的比較，並發現RNase T對受質有較高的特異性，偏好具有3’突出端結構的DNA，並產生特定長度的3’突出端。相對的ExoX對受質的特異性沒有RNaseT 高，並產生不同核甘酸長度的3’突出端，而ExoI 較偏好單股DNA。藉由以上比較我們可以證明RNaseT 作為修飾3’突出端是很理想的核酸外切酶。

DNA的修復需仰賴許多酵素的幫助，包含核酸外切酶結合並修飾DNA受損位點。透過X光繞射蛋白質結晶結構方法，呈現出RNaseT對受質結構的特異性，使RNaseT不僅在RNA成熟過程中處理雙鏈RNA的3’突出端，而且在DNA修復過程中處理bubble，bulge和Y structured DNA的3碳端時有多種功能。這些發現提高了我們對DNA修復中核酸外切酶的確切功能的理解，並推測了數千個DnaQ超家族核酸外切酶成員在DNA修復和複製中的可能作用機制。

藉由RNase T和各種不同的substrates的結晶結構來了解核酸水解外切酶為什麼切到特定的核酸時會停下來

專題生 鄭羽翔 撰

Ribonuclease T (RNase T) 為細菌中主要的3端至5端的核酸水解外切酶，屬於DEDDh核酸水解外切酶家族，此類酵素的活性特徵主要是能方向性的從3端至5端降解各種不同結構核酸分子中的3端尾端單股核酸。大部分存在於成熟的transfer RNA (tRNA) 和 ribosomal RNA (rRNA) ，對於DNA的修復功能扮演重要的角色。

儘管核酸水解外切酶是對於維持基因穩定的一個重要的酶，然而我們對於核酸水解外切酶在 DNA repair 的過程中，怎麼選擇特定的 substrates 、又或是決定要在5端或3端的地方結合及生出甚麼樣的產物，還有許多尚未了解的地方。特別是 DEDDh 的家族中，大多數的成員都有不一樣的 substrates 選擇偏好，像是特定的結構或是某段固定的核酸序列。而RNase T 同時擁有結構和特定的核酸序列選擇偏好，是屬於 DEDDh 家族中最特別的一種。

在之前的研究中，我們得知 RNase T 會受到 double-strand effect 和 C effect 的影響，造成 RNase T 的活性被抑制，也知道 RNase T 切除 small stable RNAs 時，像是 tRNA 、 5S rRNA 和 23S rRNA ，其5端尾會和3端尾形成一個含有1-4個核酸之 overhang 的雙股結構。 我們前一篇的研究已經藉由 RNase T 和 ssDNA(3’terminal G versus C) 發現單股DNA的3端C會使RNase T 形成 C effect 造成不活化性的結構增加。也發現如果雙股的最後是AT的鹼基對時，被切完後只會留下1個核酸；但如果是GC的鹼基對時，會留下2個核酸。

但是，我們目前還是不清楚為什麼 RNase T 在切單股時只會產生2個核酸，切雙股時卻能產生1-4個不等的核酸。因此，這篇主要的目的就是解決這個疑惑，而我們想出的方法是使 RNase T 和以下7個不同的單股或雙股核酸序列產生共結晶結構，藉以利用結構全面性的觀察被 RNase T 切的單股和雙股 substrates 和其所產生的產物，並提供完整的 RNase T 結合和避免過度切除的機制。

在本篇中主要會提到幾個重點，第一個是關於 RNase T 長度選擇性的問題，以往都沒有提到是怎麼選擇的，因此我們主要比對了單股中的2個核酸的 GG、GC及7個核酸但尾端是TAGG的結構來揭露其機制。第二個是關於C effect 中，C的數量多寡對單股是否有不同的影響力，因此我們比對了單股中有7個核酸且其尾端分別是AAC、ACC、TTA、AAA及AAT的共結晶結構。第三個則是探討前一篇提到的雙股中，3端尾如果有CC序列，會抑制 RNase T 的活性且最後會留下2個核酸，於是此次我們利用了一段有2個核酸的3端overhang(5-GGCCCTCTTTAGGGCCTT-3，底線是配對序列)來觀察為什麼 RNase T 無法切除CC前面的兩個核酸。第四個則是延伸第二個，想探討C的數量對於單股和雙股的影響力為什麼會有差異(前一篇研究提到在雙股3端尾中，要2個C才能幾乎完全抑制  RNase T 的活性)，因此比較了RNase T 和單股及雙股結合時的結構。最後一個則是發現RNase T 的 substrates 選擇性會受到活性位旁的 hydrophobic residues 影響，能夠藉由substrates 的不同，讓 RNase T 選擇切換到活性結構或非活性結構；而非像前人所說只是負責幫忙蛋白-DNA和蛋白-RNA的交互作用而已。

本篇的貢獻主要是建構出完整的 RNase T 切單股和雙股DNA時，會選擇的受質及其留下的尾端產物種類還有其形成原因跟結構，另外還找出hydrophobic residues對於整體結構活性的影響力。而這些的研究所發現的機制可以用來預測、推廣到整個 DEDDh 家族的核酸外切水解酶。

由蛋白結構層面釐清RNaseT在RNA 3'端成熟過程中扮演的角色

專題生 張庭瑄 撰
博士生 黃冠偉 校槁

RNA成熟(RNA maturation)依賴各種核酸水解酶參與，其中RNaseT便是參與此過程的酵素之一，透過高度保留性的DEDDh核酸水解外切酶結構域 (exonuclease domain)，RNaseT可由3’端至5’端的方向降解核酸。目前研究發現RNase T不僅能參與RNA代謝反應，也同時具備降解DNA的活性，且其DNase活性遠大於RNase活性。此外文獻亦指出RNase T的活性具有核酸序列及受質結構的選擇性。當RNase T遇到核酸受質的3’端帶有Cytosine鹼基的序列或是雙股構型時，其核酸水解活性會顯著下降甚至無法作用在此類受質，此一現象我們分別稱為C效應(C-effect)及雙股效應(Double-strand effect)。

為了進一步釐清這兩種效應的機制原理，從而了解RNase T在RNA成熟過程所扮演的角色。本篇藉由我們新解出之RNase T與各式DNA的蛋白-受質複合體結構，輔以生化分生實驗，從解構的角度來分析探討。在疊合RNase T與各式DNA複合體結構的比對結果發現，單股DNA的3’末端Cytosine鹼基會和RNase T的Phe29、Glu73、Phe77、Phe124 與Phe146交互作用，使活性位的構型改變，無法維持原先催化活性所需之特定構型。從親和性分析也觀察到，當單股DNA的3’末端或雙股DNA的3’單股突出末端為Cytosine鹼基時，會降低RNase T對該類受質的親和性。這些結果說明RNase T是如何用C-effect達成序列選擇性的機制。我們在觀察複合體結構後也發現，RNase T的活性位空間狹窄，僅夠單股核酸受質進入。再結合酵素活性分析結果，我們發現當雙股受質的3’端帶有單股長片段時，RNase T可將單股區段水解至剩約3個核苷酸長度，此時因雙股中非作用股的立體障礙，導致RNase T無法繼續水解剩餘核酸片段，此即為Double-strand effect。綜合這些結果，我們推論RNase T可以專一性的降解各種核酸的3’端單股區域，直至遇到Cytosine鹼基或是雙股區域後停止，而生成的雙股構型或3’端為Cytosine的核酸產物則會由其他酵素進行後續處理，也因此這兩種特殊的受質選擇機制與RNase T的生理功能息息相關。

本篇藉由我們新解出的多種 RNase T-DNA 複合物的結構，協以生化分生實驗分析，明確解釋了RNase T的C-effect及Double-strand effect的詳細機制，揭示了RNase T是如何具選擇性地作用在特定序列以及構型的核酸受質。這些資訊除了讓我們了解RNase T的分子層級作用機制，亦可為未來其他DEDDh家族成員蛋白的酵素活性特性與受質特異性提供了一個標準研究框架，有助於了解DEDDh蛋白與⼈類相關疾病的關係，例如 TREX1失活會導致 Aicardi-Goutieres syndrome等相關研究。

CRN-4晶體結構：CRN-4各結構域在細胞凋亡時DNA片段化中的功能分析

碩士生 楊雅韻 撰

CRN-4 ( Cell death related nuclease 4 ) 是參與C. elegans在細胞凋亡時降解DNA 的核酸酶之一。細胞凋亡是維持組織穩定、消除受損細胞和抗病毒防禦所必需，其主要特徵是特定核酸酶會將染色體 DNA片段化，若這些核酸酶失能則會造成DNA累積，導致許多核酸堆積相關的自體免疫疾病發生。

CRN-4 為DEDDh 核酸水解酶家族的成員之一，其 DEDDh核酸水解酶結構域與此家族成員間具高度的序列和結構相似性，CRN-4較其他成員多了 C 端結構域，此C 端結構域無已知結構且功能未明，所以本篇研究將透過結構和生化分析、細胞實驗來了解此結構域的功能，並剖析 CRN-4 如何參與細胞凋亡過程中DNA的片段化。

結構和生化分析中表明，CRN-4 包含DEDDh 核酸酶結構域和Zn結構域：N端的核酸水解酶結構域的活性位點胺基酸Asp 15、Glu 17、Asp 115、His 179、Asp 184與CRN-4的核酸酶活性密切相關；而C端 Zn結構域，則可識別核酸並與DNA 結合，這兩個結構域會在降解DNA 的過程中協同工作並經由細胞實驗證實。

而核酸酶活性測試更進一步表明，CRN-4 是一種Mg ²⁺ 依賴性核酸外切酶，同時具有 DNase 和 RNase 活性，其偏好受質依序為：ssRNA > dsDNA > ssDNA。並且，CRN-4在細胞凋亡的環境條件下會有最佳的 DNase活性，在CRN-4/DNA 複合物的結構模型中，也顯示出 CRN-4 的結構相當適合降解和結合 dsDNA 。因此，我們認為 CRN-4 在細胞凋亡過程中dsDNA是CRN-4的天然受質。

晶體結構分析發現CRN-4 是以二聚體存在，與家族中其他二聚體蛋白質 RNase T、PARN 和 TREX2 相比，CRN-4 的二聚體是以新穎方式形成：CRN-4的兩個活性位點位於二聚體的同一側，但相對方向和距離與其他 DEDDh家族成員不同。此新的二聚化形式可能與 CRN-4 的受質偏好性或其核酸酶活性的調節有關。

結合所有實驗數據，我們提出了一個結構模型：當細胞經歷凋亡過程時，CRN-4的 Zn 結構域會結合染色體 DNA ，並由CRN-4的DEDDh 核酸酶結構域進行切割DNA。本研究除了提供細胞凋亡中將DNA 片段化的 DEDDh 核酸酶的新結構理解，亦對CRN-4 在正常細胞中的作用和在不同細胞階段調節酵素活性的決定因素等研究奠定了基礎。